Akış sitometri yöntemiyle yabani Ayçiçeği türlerinde çekirdek DNA ile Ploidi analizi ve Orobanşa dayanımı için seçici moleküler Markırların araştırılması
Özet
Ülkemizde yağlı tohum üretimi yeterli olmayıp, bu eksiklik yüksek oranda döviz
ödeyerek ithalatla giderilmektedir. En önemli yağ bitkisi olan ayçiçeğinde verim ve
kaliteyi etkileyen en önemli etkenlerden biri de orobanş parazitidir. Ülkemizin hemen
hemen tüm ekim alanlarında giderek yaygınlaşmakta olan orobanş paraziti, sürekli yeni
ırklar meydana getirerek genetik dayanıklılığı kırmaktadır. Bundan dolayı yeni
geliştirilecek ayçiçeği hibritlerinin orobanşa dirençli olması gereklidir. Yabani ayçiçeği
türleri orobanşın yeni ırklarına dayanıklı pek çok gen kaynağına sahiptir. Bu direnç
genlerinin kültür ayçiçeğine aktarılması devamlı bir dayanıklılık için çok önemlidir. Islah
çalışmalarında moleküler metotların kullanılması, hem etkin ve doğru bir seleksiyon, hem
de çalışmalara zaman tasarrufu sağlayarak ıslah süresini kısaltmaktadır. Ülkemizde
özellikle de orobanşa dayanıklılık konusunda ayçiçeğinde moleküler markırlarla ilgili
araştırmaların sayısı oldukça azdır.
Markır analizleri için dayanıklı ve hassas ebeveyn hatlar ile bunların
melezlenmesi sonucu elde edilen F2 genotipler kullanılmıştır. Dayanıklı ve hassas F2
genotiplere ait gDNA’lar eşit miktarda bir araya getirilerek dayanıklı F2 bulk (DB) ve
hassas F2 bulk (HB)’lar oluşturulmuştur. Tez çalışması için bölgedeki orobanş ırklarına
dayanıklılık sağlayan Or5 geni hedef alınmış, literatürde bu gen ile bağlantı gösteren ve
seleksiyon için kullanılabilir olduğu ifade edilen markırlar seçilmiştir. Bunun yanısıra
çeşitli bitkilerin dayanıklılık genlerinden geliştirilen 48 markırıda bu amaçla
kullanılmıştır. Yabani türlerden önce bu melezlenmiş ve kendilenmiş ayçiçeği hatlarında
markır araştırması yapılmış, fakat orobanş dayanımının seleksiyonda kullanılabilir bir
markır tespit edilememiştir. Bu nedenle yabani ayçiçeği türlerinde, orobanşa
dayanıklılıkla ilgili moleküler markır taraması kapsamında bir uygulama yapılamamıştır.
Moleküler markır çalışmasında başarı sağlanamaması, fenotipik analizlerde kullanılan
orobanş parazitinin saf bir ırk olmayıp popülasyon olarak kullanılmasına bağlanmıştır.
Moleküler markır çalışmalarıyla birlikte, çekirdek DNA analiz ve ploidi
düzeylerini belirlemek için akış sitometrisi kullanılmıştır. Araştırmamızda kullanılan tür
ve alt türlerle birlikte 52 yabani ayçiçeği (Helianthus spp.) aksesyonu Amerika’da Ames,
IA, USA’da bulunan Kuzey Merkez Bölge İstasyonu’ndan alınmıştır. Akış sitometrisi ile
çekirdek DNA içerikleri (bazıları ilk kez) ve ploidi düzeylerini belirleyerek aksesyonların
tür farklılıkları gözlenmiştir. Çalışmada örnekler genç ve sağlıklı bitkilerden alınan taze
yaprak dokuları, floresan boya olarak propidium iodide ve internal standard olarak fiğ
bitkisi kullanılarak hazırlanmıştır. Elde edilen verilere göre; çekirdek DNA içerikleri
sonuçlarındaki değişimlerin yabani ayçiçeği türlerinin istatistiki olarak önem taşıdığı
belirtilmiştir. Kullanılan yabani ayçiçeği türlerinin 2C çekirdek DNA içerikleri 5.72 pg
(H.porteri) ile 27.11 pg (H.tuberosus) arasında değişim göstermiştir. Tezde kullanılan
türlerden daha önce çalışılmış olan türlerde yapılan DNA içerik sonuçları benzerlik
göstermiştir. Bu çalışmada daha önceki çalışmalarda olmayan birçok yeni türün çekirdek
DNA içerikleri ve ploidi düzeyleri ilk kez belirlenmiştir. Yapılan literatür araştırmaları
ve kromozom sayılarına göre 52 yabani türün yaklaşık %78’inin (41 tür) (15 Tek yıllık,
26 çok yıllık) diploid (2n) oldukları ortaya konulmuştur. Çalışılan diğer %12’lik türlerin
ise ploidi düzeyleri farklılık göstermiştir. 3 türün tetraploid (4n), 8 türün hekzaploid (8n)
olduğu belirlenmiştir. Çalışmamızda akış sitometrisi analizinin, ıslah ve taksonomik
denemelerde morfolojik gözlemlerle zor olan tür karışıklıklarının tespit edilmesinde ve
heterojen yapıda olanların belirlenmesinde kullanılabileceği ortaya çıkmıştır. Oilseed production is not sufficient for Turkey, and this deficiency is compensated
by importing with paying a high rate of foreign currency. One of the most important factor
affecting the yield and quality of sunflower which is the most important oil plant in
Turkey, is the broomrape parasite. Orobanche parasite which is becoming more and more
common in almost all cultivation areas of our country with breaking the genetic resistance
by constantly creating new races, so new developed sunflower hybrids must be resistant
to broomrape. Wild sunflower species have many sources of genes resistant to new races
of broomrape. The transferring of these resistance genes to the cultivated sunflower is so
great issue for obtaining a continuous resistance in sunflower production. The use of
molecular methods in the breeding studies shortens the breeding period by providing an
effective and accurate selection, as well as saving time. In Turkey, the number of studies
on molecular markers in sunflower is quite low especially for obtaining resistance
breeding.
Resistant and sensitive parent lines and F2 genotypes obtained by crossing them
were used for marker analysis in our study. Resistant F2 bulk (DB) and sensitive F2 bulk
(HB) were formed by combining gDNAs belonging to resistant and sensitive F2
genotypes in equal amounts. For the thesis study, the Or5 genes, which provides
resistance to the orobanche races in the region, was targeted and the markers that showed
a connection with this gene and were stated to be usable for selection were selected in the
literature. In addition, the 48 markers developed from the resistance genes of various
plants were used fort his purpose. Marker research was carried out in these hybridized
and inbred sunflower lines before wild species to obtain a usable selection of orobanche
resistance but any suitable marker could not be detected in the study. Therefore, the
molecular markers could not be performed within the scope of molecular marker
screening related to resistance to orobanche in wild sunflower species. The failure to
success in the molecular marker study was attributed to the fact that the broomrape
parasite used in phenotpic analysis was not a pure race and was used as a population.
Along with molecular marker studies, core DNA analysis and flow cytometry were
used to determine ploidy levels. 52 wild sunflower (Helianthus spp.) accessions along
with the species and subpecies used in our study obtained from the North Central
Regional Plant Introduction Station in Ames, IA, USA. It is to determine the core DNA
contents by flow cytometry (some of them for the first time) and ploidy levels were
determined by determining the type differences of the accessions. In the study, the
samples were prepared using fresh leaf tissues from young and healthy plants, propidium
iodide as fluorescent dye and vetch plant as internal standart. According to the research
data, the changes between the core DNA contents of sunflower species were determined
statistically significant. The 2C core DNA contents of wild sunflower species used varied
between 5.72 pg (H. porteri) and 27.11 pg (H. tuberosus). The DNA content result of the
previously studied species from the species used in the thesis were similar. In this study,
nuclear DNA contents and ploidy levels of many new species that were not present in the
previous studies were determined for the first time. According to the obtained results, it
was revealed that approximately 78% (41 species) of 52 wild species (15 annual, 26
perennial) were diploid (2n). The ploidy levels of the other 12% studied species differed
that 3 species were tetraploid (4n) and 8 species were hexaploid (8n). It has been stated
that flow cytometry analysis could be used in breeding and taxonomic studies to detect
species confusions that are difficult with morphological observations and to identify
heterogeneous ones.
Koleksiyonlar
- Tez Koleksiyonu [1287]