Fenolik madde tayini için lakkaz temelli amperometrik bir biyosensör geliştirilmesi ve gıda analizinde kullanımı
Özet
Gıdaların karakterizasyonunda ve insan sağlığına olası etkilerinin ortaya
çıkarılmasında fenolik bileşik içeriklerinin belirlenmesi büyük önem taşımaktadır.
Gıdalarda fenolik bileşik analizi için geleneksel teknikler maliyetlidir ve zaman alan
numune hazırlama adımları gerektirir. Günümüzde biyosensörler, bu tür geleneksel
tekniklere alternatif olarak fenolik bileşikler için güvenilir, uygun maliyetli, pratik ve
yerinde analizlere olanak sağlamaktadır.
Bu tezde, toplam fenolik bileşik tayini için basit ve kullanımı kolay bir lakkaz
temelli amperometrik biyosensör geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla Trametes
versicolor ticari lakkazı, tutuklama yöntemiyle jelatine immobilize edildi. Karbon pasta
elektrot, immobilize enzimin grafit tozu ve mineral yağ ile homojenize edilmesiyle
hazırlanmıştır. Üçlü elektrot sistemi ile yapılan amperometrik ölçümlerde standart
fenolik bileşik olarak gallik asit kullanılmıştır. Lakkaz temelli biyosensörün çalışma
koşulları ve immobilizasyon koşulları gibi deneysel değişkenler optimize edildi.
Optimum immobilizasyon koşullarına göre hazırlanan biyosensörün karakterizasyonu
ve gerçek numunelerin toplam fenolik içeriklerinin belirlenmesinde kullanılabilirliği
araştırıldı. Deneysel sonuçlara göre lakkaz temelli biyosensör için reaksiyon koşulları,
50 mM derişimli fosfat tamponu (pH 6,0) ve 40ºC; biyosensörün biyoaktif tabakası için
immobilize edilen enzim miktarı 1,25 U/5,0 µL; jelatin miktarı 2,0 mg olarak optimize
edildi. Geliştirilen biyosensörün karakterizasyon çalışmaları sonucunda, gallik asit için
doğrusal tayin aralığı 0,5-100 µM, cevap süresi 50-100 saniye ve tayin sınırı (LOD)
0,1323 µM olarak belirlendi. Tekrarlanabilirlik çalışmalarında (n=10) 20 μM gallik asit
derişiminde ortalama değer (x), standart sapma (±S.S.) ve varyasyon katsayısı (% V.K.),
20,83544 ±0,774916 µM ve % 3,7 olarak hesaplandı. Oda koşullarında depolanan
biyosensör, 10 günün sonunda immobilize enzim aktivitesinin % 86'sını korumuştur.
Geleneksel yöntemlerle elde edilen üzüm fermente içeceklerden hardaliye ve şarap
örneklerinde toplam fenolik madde tayini için geliştirilen biyosensörün performansı
değerlendirilmiştir. Eşdeğer gallik asit miktarına göre biyosensör tarafından ölçülen
toplam fenolik madde miktarı, likid kromatografi-kütle/kütle spektrometrisi (LCMS/MS)
yönteminden elde edilen sonuçlarla karşılaştırılmıştır. Ayrıca hardaliye ve
şarabın içeriğinde bulunan bazı maddelerin biyosensör cevabına girişim etkileri
araştırılmıştır. Lakkaz temelli biyosensör sonuçları, LC-MS/MS kullanılarak yapılan
analiz sonuçlarıyla karşılaştırıldığında, hardaliye ve şarap için sırasıyla % 100,44 ve %
97,2 korelasyon gösterdiği hesaplanmıştır. The determination of phenolic compound contents is of the great importance to
characterizing foods and finding out the potential human health effects. Traditional
techniques for phenolic compound analysis in foods are costly and require timeconsuming
sample preparation steps. Nowadays, the biosensors, as an alternative to
such conventional techniques, enable to reliable, cost-effective, practical and on-site
analyses for phenolic compounds.
In this thesis, the development of a simple and easy-to-handle laccase based
amperometric biosensor for the determination of total phenolic compound was aimed.
For this purpose, commercial Trametes versicolor laccase was immobilized to gelatin
by the entrapment method. Carbon paste electrode was prepared by homogenized of
immobilized enzyme with graphite powder and mineral oil. Gallic acid was used as the
standard phenolic compound for the amperometric measurements performed with the
triple electrode system. Experimental variables such as operating conditions and
immobilization conditions of the laccase based biosensor were optimized. The
characterization of the biosensor prepared according to the optimum immobilization
conditions and its utility for the determination of total phenolic contents of real samples
were investigated. According to the experimental results, the reaction conditions for the
laccase based biosensor were 50 mM of phosphate buffer (pH 6.0) and 40ºC; for the
bioactive layer of the biosensor, the amounts of immobilized enzyme and gelatin were
optimized as 1.25 U/5.0 µL and as 2.0 mg, respectively. As a result of the
characterization studies of the developed biosensor, the linear detection range for gallic
acid was determined as 0.5-100 µM, the response time as 50-100 seconds and the
detection limit (LOD) as 0.1323 µM. In the reproducibility studies (n=10), the mean
value (x), standard deviation (±S.S.) and coefficient of variation (%V.K.) at 20 μM
gallic acid concentration were calculated as 20.83544 ±0.774916 µM and, 3.7%
respectively. The biosensor storaged at room conditions maintained 86% of the
immobilized enzyme activity at the end of the 10 days. The performance of the
developed biosensor was evaluated for the determination of total phenolic compounds
in hardaliye and wine samples which are grape fermented beverages obtained by
traditional methods. The total amount of phenolic substance measured by the biosensor
according to the equivalent amount of gallic acid were compared with the results
obtained from the liquid chromatography-mass/mass spectrometry (LC-MS/MS)
method. In addition, the interference effects of some substances in the content of
hardaliye and wine on the biosensor response were investigated. The results of laccase
based biosensor correlated that 100.44% and 97.2% for hardaliye and wine,
respectively, compared with the results of the analysis using LC-MS/MS.
Koleksiyonlar
- Tez Koleksiyonu [1287]